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DNA barcoding dei Chrysomelidae dell’area mediterranea
il sito C-BAR è on-line:
Giuseppe Carlo Lozzia
Matteo Montagna
Davide Sassi
Carlo Leonardi
Stefano Zoia
Il progetto C-Bar (Chrysomelidae Barcoding) ha come obiettivo la realizzazione di una banca dati di sequenze per coleotteri crisomelidi dell’area Mediterranea (MEDLB) e si sviluppa nell’ambito del consorzio del Barcode of Life Database (BOLD). Il progetto, attivato presso il Laboratorio di Entomologia Molecolare (L.E.M. DIPSA, Università degli Studi di Milano) del prof. Giuseppe Lozzia, nasce dall’iniziativa di Matteo Montagna e Davide Sassi. Il progetto, per la verità piuttosto ambizioso, punta ad ottenere un frammento di circa 650 paia di basi del gene codificante per la citocromo ossidasi I per tutte le specie di crisomelidi presenti nell’area mediterranea. In tal modo ci si propone di realizzare uno strumento in grado di identificare a livello specifico individui adulti, stadi preimaginali e frammenti di campioni biologici. Questi dati consentirebbero inoltre l’identificazione di criptospecie non rilevabili morfologicamente e, in prospettiva, allorché le pratiche di laboratorio e la tecnologia consentiranno analisi molecolari di routine, l’identificazione della specie di appartenenza anche in assenza di conoscenze specialistiche. Quest’ultima opzione è oggetto, come è noto, di pareri controversi ed è a volte animosamente avversata. Senza entrare nel merito di questa discussione, peraltro assolutamente prematura allo stato attuale delle tecnologie disponibili, ci limitiamo a prendere atto dell’esistenza di questa proposta operativa, riservandoci di approfondirne lo studio dell’effettiva praticabilità. I dati ottenuti, inoltre permetterebbero di ottenere preziose informazioni sulla variabilità genetica intraspecifica (analizzando campioni provenienti da diverse località dell’areale della specie), sulle dinamiche evolutive e sui tempi di speciazione dei taxa analizzati.
Un’ulteriore possibilità prevista nell’ambito del progetto C-Bar, piuttosto innovativa anche nell’ambito delle rivoluzionarie applicazioni della biosistematica molecolare, è la raccolta di dati molecolari del contenuto intestinale degli esemplari “barcodati”. In tal modo si potrebbe ottenere una straordinaria quantità di informazioni sulle piante ospiti effettivamente appetite, incrementando di molto le modeste conoscenze sulla biologia della quasi totalità delle nostre specie. Infine, i dati raccolti possono essere utilizzati nei censimenti sulle faune di un determinato ecosistema o di intere nazioni, oltre che impiegati in studi di biogeografia per definire e/o completare informazioni sugli areali delle specie ed eventualmente apportare nuove conoscenze sulla fenologia.
L’approccio in uso presso il Laboratorio di Entomologia Molecolare (L.E.M. DIPSA, Università degli Studi di Milano) prevede l'integrazione tra la tassonomia tradizionale basata sulla morfologia (grazie alla presenza nel gruppo di lavoro di tassonomi specialisti) e il supporto molecolare fornito dall’analisi della variabilità genetica intraspecifica a livello della citocromo ossidasi I. Gli esemplari raccolti durante le campagne naturalistiche e preservati in alcool assoluto per la successiva estrazione degli acidi nucleici sono corredati delle informazioni di raccolta (data di raccolta, località, latitudine, longitudine, altitudine, raccoglitore ed eventuali note ecologiche). Dal momento che l’approccio molecolare non vuole e non può sostituire il tradizionale studio morfologico, ma deve accompagnarsi ad esso integrandone le informazioni, l’estrazione del DNA viene effettuata attraverso una tecnica che conserva praticamente integri i tessuti sclerificati degli insetti. In seguito gli esemplari vengono preparati a secco e conservati nelle raccolte del L.E.M. DIPSA per tutti i necessari confronti. I dati molecolari utilizzati nella ricerca sono depositati all’interno del database BOLD ed NCBI e, una volta pubblicati, saranno liberamente utilizzabili da qualsiasi utente registrato.
Ad oggi, al termine della fase preliminare dello studio,si sono ottenute sequenze molecolari per 582 campioni appartenenti a 208 specie (vedi elenco) provenienti da diverse località dell’area mediterranea (Italia, Francia, Tunisia, Grecia, Turchia). Sono attualmente in fase di processamento ulteriori 178 campioni (32 specie). Entro l’estate del 2012 la banca dati comprenderà dunque sequenze appartenenti a 240 taxa con un minimo di 4 esemplari analizzati provenienti da diverse località dell’areale.
Il progetto non prevede ad oggi una data di chiusura. Pur essendo a scadenza la collaborazione del consorzio BOLD, abbiamo in programma di proseguire ad oltranza le ricerche e di impegnarci per il reperimento dei fondi necessari alla conduzione delle onerose tecniche di laboratorio.
Come partecipare all’iniziativa
L’iniziativa di ampio respiro in cui siamo coinvolti necessita di aiuto nella raccolta degli esemplari provenienti da diverse località, sia per aumentare il numero di specie processate all’interno della banca dati sia per avere una buona rappresentanza della variabilità genetica intraspecifica analizzando esemplari di diversa provenienza. La collaborazione, anche saltuaria, di amici e colleghi entomologi è dunque non solo auspicabile, ma di fatto indispensabile per la buona riuscita del progetto. Invitiamo pertanto i tanti disponibili entomologi presenti sul territorio nazionale e non a considerare la possibilità di fornire un prezioso apporto al progetto attraverso la raccolta di materiale.
Se sei interessato a collaborare
contatta Matteo Montagna (matteomontagna@hotmail.com) o Davide Sassi (davidesassi14@gmail.com) e ti invieremo il kit del DNA barcoder (provette, pinzette ed etanolo assoluto per lo stoccaggio dei campioni) e il manuale per la raccolta dei campioni. Anche pochi esemplari di specie relativamente comuni possono essere molto interessanti se provenienti da zone di cui abbiamo pochi campionamenti. Per questo motivo chiunque è in grado di fornire un contributo davvero importante.
Ringraziamenti
Nell’occasione cogliamo l’opportunità di ringraziare pubblicamente gli amici che già in passato hanno fornito interessantissimo materiale, e cioè Fernando Angelini, Maurizio Bollino, Andrea Carlin, Loris Colacurcio, Juan de la Rosa, Francesco Izzillo, Carlo Leonardi, Gianluca Magnani.
Bibliografia
Herbert PDN, 2005. The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy. Systematic Biology, 54: 852-859.
Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR, 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci, 270: 313-321.
Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR, 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci, 270 Suppl 1: S96-S99.
Will KW, & Rubinoff D, 2004. Myth of the molecule: DNA barcodes for species cannot replace morphology for identification and classification. Cladistics 20: 47–55.
Kubisz D, Kajtoch L, Mazur MA, Rizun V, 2012. Molecular barcoding for central-eastern European Crioceris leaf-beetles (Coleoptera: Chrysomelidae). Cent Eur J Biol, 7:69-76
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DNA barcoding of the Chrysomelidae of the Mediterranean Region
C-BAR site is on-line:
Giuseppe Carlo Lozzia
Matteo Montagna
Davide Sassi
Carlo Leonardi
Stefano Zoia
The goal of the C-Bar (Chrysomelidae Barcoding) project, developed within the consortium of Barcode of Life Database (BOLD), is the creation of sequences database for the Leaf Beetles of the Mediterranean region (MEDLB). The project, activated at the Molecular Entomology Laboratory (LEM DIPSA, University of Milan) by prof. Giuseppe Lozzia, was founded by the idea of Matteo Montagna and Davide Sassi. The project aims to obtain a fragment of approximately 650 base pairs of the gene coding for cytochrome oxidase I for all the chrysomelid species present in the Mediterranean Region. The purpose is to realize a tool able to identify at species level adult, pre-imaginal stages and fragments of biological samples.
The obtained molecular data (650 bp of COI gene) allow also the identification of criptospecies undetectable morphologically. Moreover, when laboratory practices and technology will allow routine molecular analysis, even the species identification in the absence of expertise will be possible. These data permit to obtain valuable information on the intraspecific genetic variability (analyzing samples from different localities of the species distribution area), on the evolutionary dynamics and on the timing of speciation of the taxa analyzed. A further possibility provided by C-Bar project, quite innovative even in the context of the revolutionary applications of molecular biosystematics is the molecular characterization of the gut content of the specimens. In this way you could get an overwhelming amount of information on the host plants, greatly increasing the modest knowledge of the biology of the majority of our species. Finally, the collected data can be used in the census on the fauna of a particular ecosystem or of entire nations, as well as in biogeographic studies to define and/or complete information on the species distribution and possibly increase knowledge about the species phenology.
The approach used by the Laboratory of Molecular Entomology (LEM DIPSA, University of Milan) provides integration between the traditional taxonomy, based on morphology, and the support provided by molecular analysis of intraspecific genetic variability. The specimens collected during the campaigns are preserved in absolute alcohol for subsequent DNA extraction and are accompanied by the collection information (i.e. collection date, location, latitude, longitude, altitude, collector and ecological notes).
Since the molecular approach will not and can not replace the traditional morphological study, but must accompany the traditional taxonomy by integrating information, DNA extraction is performed using a technique that preserves the insect morphology. Then the samples are prepared and dry stored in the collections of the LEM DIPSA for all the necessary comparisons.
The molecular data used in research are deposited in the NCBI database and BOLD and, once published, will be used freely by any registered user.
To date, at the end of the preliminary study, we have obtained molecular sequences for 582 specimens belonging to 208 species (alphabetical list) from different localities in the Mediterranean (Italy, France, Tunisia, Greece, Turkey). By the summer of 2012 the database will include, therefore, sequences belonging to 240 taxa with a minimum of 4 analyzed samples from different locations.
At present the project does not present a closing date. Although the great cooperation with the BOLD consortium is close to its ending, we plan to continue the research and we are working to raise founds needed in order to run the expensive laboratory procedures.
How to get involved
The initiative in which we are involved needs help in order to collect specimens from different localities, to increase the number of processed species within the database and to have a good representation of intraspecific genetic variability by analyzing samples of different origin.
The collaboration, even occasional, of friends and entomologists is desirable and in fact essential for the success of the project. We therefore call on all the entomologists available to give us their valuable contribution to the project by collecting the material.
If you are interested in helping us
please contact Matteo Montagna (matteomontagna@hotmail.com) or Davide Sassi (davidesassi14@gmail.com) and we will send you the DNA Barcoder kit (test tubes, tweezers and absolute ethanol for the samples storage) and the manual for the manipulation of the samples. Even few specimens of relatively common species, can be very interesting if they come from areas where we have only few samples. For this reason, everyone is able to provide a very important contribution.
Acknowledgments
We take this opportunity to publicly thank the friends who in the past have provided interesting material, namely Fernando Angelini, Maurizio Bollino, Andrea Carlin, Loris Colacurcio, Juan de la Rosa, Francesco Izzillo, Carlo Leonardi, Gianluca Magnani.
References
Herbert PDN, 2005. The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy. Systematic Biology, 54: 852-859.
Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR, 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci, 270: 313-321.
Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR, 2003b. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc Biol Sci, 270 Suppl 1: S96-S99.
Will KW, & Rubinoff D, 2004. Myth of the molecule: DNA barcodes for species cannot replace morphology for identification and classification. Cladistics 20: 47–55.
Kubisz D, Kajtoch L, Mazur MA, Rizun V, 2012. Molecular barcoding for central-eastern European Crioceris leaf-beetles (Coleoptera: Chrysomelidae). Cent Eur J Biol, 7:69-76
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